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人绒毛膜促性-腺激素与内分泌疾

来源:未知作者:秒速时时彩 日期:2019-05-17 浏览:

  人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG) 是由两个不同的亚基,α、β以非共价键连接组成的一种糖蛋白激素。生理状态下,人绒毛膜促性腺激素是由妊娠滋养细胞产生,对维持妊娠黄体,进而维持早期妊娠,具有关键性的作用。病理状态下,hCG可出现于滋养细胞疾病与肿瘤、卵巢绒癌、睾丸肿瘤等疾病时。作为生物标志物,hCG是迄今为止最好的妊娠诊断标志物;作为肿瘤标志物,hCG是少有的对于肿瘤的临床诊治具有重要决定作用的标志物之一,在妊娠滋养细胞疾病(gestational trophoblastic tumor, GTD)诊治中,hCG检测可作为诊断、治疗和随访的独立指标应用于临床,hCG的检测结果在相当的程度上引导着医生的临床决策。

  理论上,hCG测定结果的临床判读与结果分析似乎是简单明了的事:育龄女性其血清hCG值大于或等于50IU/L时作为生理状态,即可诊断妊娠;在非正常妊娠情况下,不论是否为生育年龄出现hCG的升高均应考虑存在有分泌hCG的疾病或肿瘤,在男性出现hCG升高也应考虑相关疾病与肿瘤。用作肿瘤标志物作为治疗检测时hCG的水平与肿瘤的消长成正相关,但作为GTD等分泌hCG疾病与肿瘤的疗效观察时,要求hCG水平小于10IU/L才属正常。对hCG用于妊娠的诊断与用于GTD等分泌hCG疾病和肿瘤的疗效观察分别采用50IU/L和10IU/L不同的临界标准是取决于医疗决定水平。因为有极少数的妇女非妊娠期的基础hCG可在10~50 IU/L之间,hCG50IU/L作为正常妊娠的临界值最大程度的避免了妊娠诊断的假阳性;而hCG10IU/L作为GTD等分泌hCG疾病和肿瘤的治疗缓解临界值可最大程度的保证治疗的有效性。

  临床实践中,病人循环血、尿液、脑脊液等体液中的hCG定量或定性检测主要依靠标记免疫学技术。目前用于hCG检测的标记免疫技术有数种,不同的实验室与不同方法检测的hCG可出现不同的结果,研究发现hCG的分子实际上不止一种,这给临床应用增加了不确定因素。因此,临床上医生根据hCG的检测结果作临床决策时应充分了解hCG及其相关分子,了解实验室检查的作用与局限。

  在hCG的产生、分泌、代谢等过程中,其分子会发生断裂、离解等多种变化,从而在血、尿中以多种分子形式存在。hCG及其相关分子的测定在临床上有广泛应用,包括:用于早期妊娠的诊断;提示异常妊娠的出现(如先兆流产、唐氏综合症等);诊断和监测妊娠滋养层疾病(葡萄胎、绒癌等);作为一种肿瘤标记物用以识别一些非妊娠性恶性瘤(如睾丸癌、胚胎细胞瘤),并监测其治疗和愈后情况。

  从测定hCG的免疫学方法问世就已经注意到hCG的分子可能以多种形式存在。对hCG分子结构的研究已经有30多年了,这些研究主要用于提高hCG对妊娠及其相关疾病或肿瘤的诊断与治疗水平,这些疾病包括滋养层疾病与肿瘤、睾丸肿瘤和非性腺的、非胎盘的肿瘤等。1992年有人选用美国市场上10种不同厂家生产的hCG 放免测定试剂,测定了40份标本,结果显示各标本用不同试剂测得的值均有差异,最大的相差58倍。近年采用的化学发光等诸方法测定hCG,也发现不同的试剂盒对同一标本的检测可呈现不同的结果。原因:各标本中“hCG”的组成及其组成比例不同,各试剂对各种“hCG”的检测特异性与敏感性不同。用各种免疫学方法检测到的hCG实际上是一组分子结构有差异,但有相同抗原性的混合物(Mixture)。对hCG 分子结构的研究表明:以多种形式出现在生物体液中的hCG除了规则hCG (regular hCG)以外,还有下述多种变体(variants),包括:高糖基化hCG(hyperglycosylated hCG)、游离hCG β-亚基(free β-subunit)、游离hCG α-亚基(free α-subunit),以及各种不同的hCG碎片,如缺刻分子hCG (Nicked hCG)和缺刻的游离β- hCG (Nicked free β-subunit),高糖基化游离β-hCG (hyperglycosylated free β-subunit)以及在尿中检到的游离β-hCG核心片段(β-core fragment)等,见表:

  规则分子的hCG由α、β两个亚基组成,以非共价键结合的方式组成,它们有大约10%的氨基酸排列顺序相同并且有近似的交叉结构。α亚基和β亚基分别有5-6个二硫化合物网桥。两个亚基相互结合,但仍能显示出其具有的独立性。β亚基是145个氨基酸残基组成的糖肽,其结构独特,决定了hCG与其它糖蛋白激素不同的生物学特性。α糖肽的氨基酸残基上有天冬酰胺酸链半糖基链相连,在β糖肽碳末端上有丝氨酸半糖基链相连,糖基总量占其分子量的35%,这些糖基使hCG成为一个特殊的糖蛋白,具有8个寡聚糖基侧链致使hCG分子有很大的异质性。规则分子的hCG具有生物学活性,即使用免疫学方法测出也用生物活性有关的每升国际单位(IU/L)表示,而下述的和hCG相关分子由于不存在生物活性多用重量(ng/ml)表示。规则分子的hCG具有以下生物学活性:

  1、孕早期类似于LH(代替LH)促黄体功能。使其合成雌、孕激素直至孕 12周左右胎盘开始合成雌、孕激素。

  5、调节胎盘类固醇激素的合成,胎盘合体滋养细胞有hCG特异调节的腺苷酸环化酶。

  6、促使睾丸间质细胞分化、肥大、增加雄激素的分泌(对无精症则无促生精作用)。

  α亚基呈游离状态。α亚基的基因编码区位于第6号染色体的长臂,表达产物含92个氨基酸残基,分子量14.5Kda,由腺垂体和胎盘组织共同表达,与其他一些垂体激素LH、FSH、TSH的α亚基高度同源,氨基酸序列几乎完全相同。hCG游离α亚基在血、尿中多以两种形式存在:一是规则游离α亚基,是规则hCG的组成部分;二是大分子游离α亚基,这是一个高糖基化的α亚基,其连接的N联糖基结构比规则α亚基更大、更为复杂。这种α亚基不能与β亚基组成规则hCG,可能是其复杂的糖基结构阻碍了与β亚基的结合。

  β亚基呈游离状态。hCG的β亚基的基因编码区位于第19号染色体的长臂,其表达产物含145个氨基酸残基。hCG的β亚基决定了hCG的特异性,它是决定整个hCG分子具有生物活性和免疫反应特异性的关键。尽管hCG的β亚基与LH的β亚基结构非常相似(在121个氨基酸分子中,有97个两者是完全相同的),但是β- hCG的特异性表现在它有丰富的丝氨酸,延伸成为具有羧基化末端(C-terminal)的缩氨酸(24个氨基酸)。这些羧基化末端的交叉结构能被特异性的抗体识别,进行免疫反应,而这种结构在LH分子中就很少,甚至一点也没有。末端抗体用于检测hCG就显示出其独特的重要性。

  其它能够用于识别的hCG的结构不多(低于20%),而且缺少生物学活性。残缺hCG,有α、β两个链,但是链中的氨基酸残基缺少。如在β亚基的47和48号氨基酸的位置上,有一个断开部,氨基酸缺损。最常见的断开部位为β链的47/48,有时也在43/44或44/45断裂。由于hCG特异的抗原决定簇位于β链羧基末端的最后30个氨基酸,所以缺刻hCG仍有hCG的免疫反应活性,用免疫方法难以分辨出。

  hCG游离β亚基在促性腺激素β亚基缺刻酶的作用下,也有规则与缺刻之分。规则游离β亚基与组成规则hCG的β亚基相同;缺刻游离β亚基在β47-48位 (少数在 43-44、44-45位)发生断裂。对缺刻游离β亚基还有另一种范围更广的定义,即包括全部或部分羧基末端(CTP)丢失的β亚基及β核心片段。其中全部CTP丢失指β93-145片段的缺失,而部分CTP丢失一般指β123-145片段的缺失。

  β核心片段是β亚基的核心结构。它由两个肽段组成,分别是β6-40和β55-92,两者通过二硫键连接形成。β核心片段在糖基结构上与β亚基存在不同,这个片段在Asn13和Asn30上同样连接有两个双向结构的N联寡糖,但是其添加的唾液酸缺乏,半乳糖的数量也减少(研究显示:在β核心片段约为2.3Gal/分子,而在规则β亚基是7-8 Gal/分子);连接半乳糖的糖苷键与规则β亚基也可能不同,β核心片段可能是β1,3或α1,3糖苷键,而规则β亚基是β1,4糖苷键。

  hCG -β亚基的主要代谢产物是β核心碎片,这种碎片仅在尿中可以检测到,被学者冠以多种命名,其中包括尿刺激生殖腺缩氨酸(urinary gonadotropin peptide, UGP)。β核心碎片的测定可以为卵巢癌、膀胱癌和颈部癌症的跟踪治疗提供信息帮助。

  高糖基化hCG与规则hCG的蛋白质骨架结构基本相同,只是高糖基化hCG在表达分泌过程中,亚基上修饰的糖基比例显著增多,且修饰的糖基分子质量更大,结构更为复杂。

  规则hCGα亚基在天冬酰氨Asn52和Asn78上连接单向和双向结构的两个N-联寡糖;β亚基在Asn13,Asn30上也连接两个N-联寡糖,两个N-联寡糖可能都是双向结构;β亚基上还有4个O-联寡糖单位(多为3糖)连接在特有的富含脯氨酸和丝氨酸的羧基末端(CTP)区域(β122~145)。高糖基化hCG的寡糖侧链其结构和糖基种类与规则hCG均不同,突出的是β亚基末端连接的O-联寡糖结构。规则hCG的O-联寡糖结构只含少量6糖(20%),而高糖基化hCG的O-联寡糖结构主要是6糖(48%~100%)。此外,高糖基化hCG连接的N-联寡糖与规则hCG也有不同,N-联寡糖在原有的糖基基础上,还添加大分子质量的岩藻糖;而且规则hCGα、β亚基的N-联寡糖含6.8%和14%左右的三维结构,高糖基化hCGα、β亚基的N-联寡糖含9.8%和51%左右的三维结构。近来又发现高糖基化hCG连接的寡糖末端的唾液酸含量相对规则hCG常明显减低。

  妊娠及其相关疾病是hCG分子的主要来源。正常妊娠的滋养细胞产生规则分子的hCG,高糖基化hCG和游离β亚基。虽然规则分子的hCG可分解产生为α和β亚基,但规则hCG分子的两个亚基(α和β亚基)以非共价键结合的方式组成,相对稳定。分泌过程中, 经过糖基转移酶作用,它们可以以独立的游离α亚基和β亚基形式分泌;或者成为一个二聚体,以规则的hCG分子的形式分泌。

  高糖基化hCG主要由细胞滋养层细胞产生。细胞滋养层细胞是未分化的分裂生长的细胞,是妊娠初期(受精卵植入后的最初6周)和一些妊娠滋养细胞疾病如绒癌分泌hCG的主要滋养层细胞。正常妊娠中,随着妊娠的进展,细胞滋养层细胞逐渐转为分化成熟的合体滋养层细胞。

  滋养层细胞分化过程可简单概括为:细胞滋养层细胞→细胞滋养层中间体→合体滋养层中间体→完全分化的合体滋养层细胞。细胞滋养层细胞和细胞滋养层中间体主要分泌高糖基化hCG,前者分泌的量比后者多;而合体滋养层中间体和完全分化的合体滋养层细胞主要分泌规则hCG,后者分泌的量比前者多。随着滋养层细胞的分化成熟,分泌的主要hCG分子由高糖基化hCG转为规则hCG。高糖基化hCG主要在妊娠初期大量存在。妊娠初期高糖基化hCG水平占总hCG的比例明显高于规则hCG;至妊娠6周后高糖基化hCG所占比例迅速下降,与规则hCG的比值发生逆转;从妊娠7周到足月,高糖基化hCG维持在一个很低的水平(不足各类hCG总量的10%)。若至妊娠7周出现高糖基化hCG仍维持在较高水平而不下降,常预示妊娠的异常,因此检测高糖基化hCG是评价妊娠是否存在异常的指标之一。

  在妊娠滋养细胞疾病,具有侵袭性的细胞滋养细胞分泌hCG分子与成熟的正常滋养细胞不同,hCG及其相关分子的产生机制或生物合成迄今尚未完全阐明。此外,在某些非妊娠相关疾病患者的血中也发现hCG及相关分子,提示非滋养细胞也能产生hCG及相关分子。主要为一些分化不良的恶性肿瘤细胞,包括生殖细胞肿瘤,类癌瘤,垂体腺瘤,胰岛细胞癌和非内分泌恶性肿瘤。近年越来越多报道的非生殖细胞肿瘤,已发现的有生殖系统肿瘤中的上皮性卵巢癌、宫颈癌和非生殖系的肺癌、膀胱癌、前列腺癌和多种肉瘤等。在这些情况下,一般以分泌异常的缺刻和/或糖基化hCG分子为主。此外,尚存在无妊娠、癌症和疾病证据的垂体来源hCG,如尿毒症。垂体的促性腺细胞正常情况下可产生微量的hCG和hCG-β核心片段(0.5mIU/ml)。

  合体细胞滋养层产生hCG及相关分子并降解代谢的过程一般如下:胎盘绒毛组织表达合成规则hCG、大分子游离α亚基、规则游离β亚基,部分规则hCG在β47-48氨基酸断裂(或β43-44、β44-45)形成缺刻hCG。分子分泌到血液中,缺刻hCG不稳定,分泌中或分泌到血液后,一部分离解形成规则游离α亚基、缺刻游离β亚基;而规则游离β亚基在血液中也部分断裂形成缺刻游离β亚基。这些分子有一定量经由尿液排泄,其中缺刻游离β亚基经肾脏排泄时,大部分降解成β核心片段。根据β核心片段只在尿液中存在,不在血液中存在,证实β核心片段在肾中降解产生,且缺刻游离β亚基是β核心片段生成的底物。

  规则hCG、规则游离β亚基,和大分子游离α亚基可以由胎盘滋养层细胞直接分泌产生,而缺刻hCG、缺刻游离β亚基和β核心片段不能由滋养层细胞直接分泌产生。缺刻hCG和缺刻游离β亚基极不稳定,它们是hCG代谢降解的一种过渡形式,总结hCG的降解途径为:hCG→缺刻hCG→缺刻游离hCGβ亚基→β核心片段。

  高糖基化hCG的降解途径与规则HCG基本相同,但两者的缺刻位点数目有所不同,高糖基化hCG一般有三个缺刻位点,而规则HCG只有一个缺刻位点,故高糖基化hCG可能比规则hCG代谢要快。

  许多出版物描述了检测hCG多种相关分子结构在非正常妊娠、非整倍体妊娠、习惯性流产、先兆流产、子痫前期、滋养细胞疾病或肿瘤等方面应用的临床价值。对于那些高度可疑滋养细胞疾病或肿瘤的患者,血清总hCG(包括全段hCG、残缺hCG、游离β亚基和残缺游离β亚基)的可靠监测是非常必要的。这样的监测可以避免病人接受不必要的化学药物治疗。另外,如果hCG发生变化或治疗后复查hCG无明显变化,可以较早得到是否改变化疗方案或采用其它治疗方法的信息帮助。

  妊娠可以使hCG水平升高,特别是在受精卵着床于子宫内膜后的一段时间内,hCG数量会增加很多。早在怀孕后的第6天,血中就可以发现hCG,这一时间相当于正常月经周期LH高峰后的大约8-10天。随后,hCG水平迅速上升,估计在怀孕后的8-9周达到最高峰,随后开始下降。大约在妊娠4个月末,hCG稳定,并维持到妊娠结束。由于怀孕,使循环中的残缺hCG水平升高,在怀孕的第2个月初,检测总hCG水平仅有9%的孕妇升高,而在邻近预产期大约21%的孕妇残缺hCG水平升高。

  在正常妊娠和宫外孕的早期,血中hCG处于低水平状态,这时羧基化末端抗体用于检测hCG就显示出现其独特的重要性,显示了分子学研究的临床意义。

  hCG测定是诊断滋养细胞疾病或肿瘤最重要的手段。一般来说,葡萄胎清除后84-100日血清hCG降至非孕正常水平,人工流产和自然流产后分别约需30日和19日,足月妊娠分娩后约12日,异位妊娠后约8-9日。若超过上述时间,血清hCG仍未达到正常水平,在排除葡萄胎或妊娠残留物后要考虑滋养细胞肿瘤。hCG动态测定比单次测定更有意义。若本次测定值高于上周测定值10%,则为上升;若高或低不足10%,为持续状态;若降低超过10%,则为下降。在排除葡萄胎或妊娠残留物的前提下,若hCG异常上升,尤其是持续上升,可诊断为滋养细胞肿瘤。若持续状态,如无子宫肌层侵犯和子宫外转移证据,可持续观察1-2周;若下降,可继续观察,直到正常。

  疑有中枢神经系统转移时,可测定脑脊液hCG,并与血清hCG比较。当脑脊液hCG:血清hCG 1:60时,有中枢神经系统转移可能。

  1、游离α- hCG 只有一条α链,且与LH、FSH、TSH的α链,氨基酸序列几乎相同,特异性较差,需要专门测α-亚基的试剂方能准确测出,多在研究游离α- hCG亚基与游离β-亚基比例时才作测定。游离α亚基检测的临床应用尚待进一步探讨、研究。游离α亚基可出现在怀孕妇女和绝经后妇女的血清中,某些疾病患者的血中也可发现,如葡萄胎,绒毛膜癌,类癌瘤,垂体腺瘤,胰岛细胞癌,尿毒症和非内分泌恶性肿瘤。但是游离α- hCG水平常常极低,在正常妊娠时α- hCG / hCG比值在0.1-0.3% ;在滋养细胞疾病与肿瘤时α- hCG水平也不高,α- hCG / hCG 比值很少超过0.5%。

  2、游离β- hCG(F-β- hCG) 实质上是呈现游离状态的hCG-β亚基即无α-亚基者。hCG-β亚基只在胚胎细胞表达。F-β- hCG 水平变化的临床意义正日益受到重视。恶性肿瘤病人游离β-HCG水平增加。 正常妊娠时hCG量从数十单位到数十万单位,而F-β- hCG的含量很低、 波动小,只有几十到几百;F-β- hCG增高,即使hCG在正常范围,往往也提示有病理情况。但是F-β- hCG的测定并非一般的β- hCG测定需要采用特定的试剂作检测。F-β- hCG增高的分子生物学基础可能是⑴β-亚基基因过度表达:α-亚基由第6号染色体长臂基因编码,β-亚基由第19号染色体长臂的基因编码,两组基因表达不协调导致游离亚基增多;⑵亚基的氨基酸缺损或结构异常 (异常的方式糖基化),不能以非共价键的方式结合,游离者增多。有研究报道F-β- hCG可用于滋养细胞疾病与肿瘤的鉴别诊断,正常妊娠85%的标本F-β- hCG/hCG 1.0%,78%的标本F-β- hCG/hCG 0.5%;而葡萄胎F-β- hCG/hCG可到5%;侵蚀性葡萄胎、绒癌F-β- hCG/hCG则可达10%以上。F-β- hCG用于滋养细胞肿瘤的治疗监测较hCG更敏感,hCG血清半衰期24-36小时,而F-β- hCG血清半衰期仅12-14分钟。

  (1)F-β-HCG/HCG比值可用于滋养细胞疾病与肿瘤的诊断与鉴别诊断:血清hCG水平是滋养细胞疾病与肿瘤诊断及治疗标志物。但是单一的hCG水平升高,并不能以此诊断或鉴别诊断妊娠与滋养细胞疾病与肿瘤。石一复等报道妊娠、葡萄胎、侵蚀性葡萄胎及绒癌血清中均可测到高水平的hCG和F-β-hCG,两者的动态范围均很广,各组上下界限有明显的交叉或重叠,资料呈非参数分布。因此不能用均数来比较哪一组hCG或F-β-hCG的水平更高。但是F-β-hCG/hCG比值,在妊娠组显著低于滋养细胞疾病与肿瘤组(P0.005),虽然也可高达5.9%,但绝大多数情况下1.0%。此可作为妊娠与肿瘤的参考界限。同时侵蚀性葡萄胎与绒癌的F-β-hCG/hCG值又显著高于葡萄胎组(P0.005),因此,此比值的高低对于判断葡萄胎是否具恶变倾向也有重要价值。

  完整的hCG分子由α、β两个不同的亚基组成,以非共价键的方式结合在一起。但是在某种情况下,这两个亚基也可以以游离或非结合形式存在,不同亚基的存在水平变化可具有不同的临床意义。由于hCG的α-亚基不仅在胚胎细胞表达,也可以在崔体细胞得以表达,因此与LH、FSH、TSH的α亚基类似,而β-亚基只在胚胎细胞表达,因此研究β-亚基的消长及其与完整分子hCG的比值已成为研究胚胎状况或滋养细胞肿瘤的焦点之一。F-β-hCG/hCG比值对滋养细胞疾病与肿瘤具有诊断与鉴别诊断价值。

  (2)F-β-hCG相对增高是细胞恶变或恶变程度的标志:F-β-hCG/hCG比值增高,实质上是胚胎滋养细胞,尤其是合体细胞发生恶变的一种表现。HCG的α-亚基与β-亚基由不同的基因编码。α-亚基的编码基因位于第6号染色体长臂,而β-亚基的基因图则位于第19号染色体的长臂,推测在胚胎组织中,只有α-亚基与β-亚基同时准确表达,才能使细胞与血清中有大量具生物学活性的完整hCG分子。如果,-其中某一个基因表达有增加或减少,或者基因表达错误,如β-亚基的氨基酸缺刻或被替换等,有可能使α、β两亚基结合受阻,均可导致游离亚基的增多。因此,从细胞遗传学和分子生物学水平看,F-β-hCG增多极可能是基因表达异常所致,虽然有关机理需进一步探讨,但这本身应是细胞异常或癌变的一种象征。

  石一复等收集了一例妊娠合并绒癌病例,此病例为妊娠(活胎)5个月伴发胸水入院,虽然hCG值较高(80480IU/L),初步诊断为妊娠合并绒癌,但一时尚未发现其他诊断依据,包括X线肺部摄片。但血清F-β-hCG值为1030ug/L,F-β-hCG/hCG比值高达20%。后经产科处理后出现了脑转移症状,确诊为妊娠合并绒癌。因此当F-β-hCG/hCG值显著增高时应高度重视有恶性滋养细胞肿瘤的存在。

  (3)有关F-β-hCG的检测:由于F-β-hCG是完整hCG的一部分,因此在β-亚基部分两者的抗原性几乎完全相同,绝大多数β-hCG检测试剂能同时测出完整的hCG与游离的β-亚基。由于F-β-hCG没有α-亚基结合,推测其空间构型可发生改变导致部分抗原决定簇有相对特异性,因此检测F-β-hCG是使用单克隆抗体筛选的专用试剂,决非一般β-hCG测定试剂可替代。即使如此,在hCG高浓度时F-β-hCG检测仍可与hCG交叉产生假阳性。

  由于hCG的α与β亚基以非共价键形式结合,因此,血清处理保存不当,操作不当均有可能导致α、β亚基分离,造成认为的F-β-hCG增高,这在测定时必须引起重视。

  3、高糖基化hCG 在妊娠滋养细胞疾病(葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌)中,高糖基化hCG的水平与总hCG的比值明显高于正常妊娠组,且与疾病的恶性程度呈正相关。

  高糖基化hCG除辅助诊断妊娠滋养细胞疾病外,还可用于妊娠滋养细胞疾病的治疗后监测。有研究者发现部分有葡萄胎或其他妊娠滋养细胞肿瘤病史但无临床症状的妇女的血清中可检测到持续存在的低浓度hCG水平(已排除假阳性情况),这种低水平hCG可持续存在几年或十几年。这种低水平hCG的存在,可能误导医生的临床诊断并采取不必要的治疗,增加患者的痛苦。Cole 等收集较大量有妊娠滋养细胞疾病史但无临床症状的标本,检测到低水平的hCG,其浓度大多100 IU/L。同时检测高糖基化hCG浓度,发现基本2 IU/L。对hCG浓度显著增加者,高糖基化hCG水平也明显增加,而且是总hCG浓度增加的主要来源,占总hCG的百分比可达100%。随着高糖基化hCG水平的增加,临床可发现疾病转为恶性瘤或肿瘤进一步恶化发展。因此监测妊娠滋养细胞疾病的术后情况,检测高糖基化hCG比总hCG更为直观,更有标志价值。

  对于睾丸肿瘤,hCG的检测与α-fetoprotein(AFP)检测联合使用,可以帮助确定肿瘤的类型(精原细胞瘤,非精原细胞瘤)、判断预后和治疗。这些肿瘤标志物的检测是必要的监测手段,治疗后任何一种标志物回升异常,提示治疗效果不理想,仍有残存的肿瘤存在。在确诊的睾丸肿瘤患者中,游离β亚基与hCG的比率可以达到很高,看似仅仅是分泌游离β亚基,事实上部分来源于没有查明的全段hCG。

  随着免疫分析技术的发展,hCG检测技术也渐趋成熟。传统检测技术主要是检测hCGβ亚基的放射免疫分析(RIA),采用hCGβ亚基多克隆抗体测定含β亚基的各种hCG相关分子(包括规则和缺刻的hCG、游离β亚基,β核心片段)。随着技术的发展,自动和手动夹心免疫分析(或称二位相免疫分析)逐渐替代了传统RIA分析,采用单克隆抗体的混合物检测相应的各种相关分子,利用荧光免疫、发光免疫、酶免疫、金免疫等检测技术通过精密光谱仪快速检测。这些方法具备高特异性、高灵敏性、高效性。

  过去,同一标本出现不同hCG测定值多是因为方法的特异性差,受其它垂体激素的干扰。现今随着抗体特异性的提高,免疫测定水平在提高,hCG标准品的高度纯化,已很少或不受垂体激素的影响。至今测定hCG的商用药盒已有几十种,但由于目前对hCG抗原特性了解不够充分,对免疫测定利用的单克隆抗体识别的抗原决定簇的分子位点不清,各实验室使用的检测抗体所针对的抗原位点常有不同,不同的商用药盒对测定的分子和测定的方法不同,以及使用的国际标准分子异源性,致使不同检测之间的结果可比性仍存在问题,也因此引起一些临床问题。

  比较实验室常用的多种抗体,发现hCG和其亚基一般有如下一些抗体结合位点:规则hCG有六个(α1、β1、β2、β3、β4、αβ),缺刻hCG是五个(α1、β1、β2、β3、β4),游离β亚基有三个(β1、β2、β4),游离α亚基只有一个(α1),β核心片段则有两个(β1、β2)。测定时如使用针对αβ、β1两个位点的夹心法,则只检测规则hCG;若使用针对α1、β1两个位点的夹心法,则能检测规则hCG和缺刻hCG。如此,对其他一些成分的检测,若选用抗体不同,检测结果往往存在差异。

  针对这些情况,应根据临床诊断采用相应的检测抗体以检测有意义的hCG分子。例如,规则hCG有生物活性,而其他hCG相关分子一般没有活性或活性很低,要观察激素的生物活性,最好检测规则hCG;又如游离hCGβ亚基在肿瘤疾病常显著升高;β核心片段是早期妊娠尿标本的重要成分等等。

  近期国际肿瘤发展生物和医学协会的多中心研究提示,在常规诊断中,推荐使用广谱能识别hCG及相关分子,与其它糖蛋白质激素及衍生物低交叉的hCG试验。最理想的是能识别半胱氨酸结周围和hCG-β环1和环3顶端的抗原决定簇。

  GTT中低水平hCG问题受到关注有20年左右的历史, 2001年召开的第十一届世界滋养细胞疾病会议上才有真正低水平hCG综合症的临床报道。研究者发现部分有葡萄胎或其他妊娠滋养细胞肿瘤病史但无临床症状的妇女的血清中可检测到持续存在的低浓度hCG水平(已排除假阳性情况),这种低水平hCG可持续存在几年或十几年。这种低水平hCG的存在,可能误导医生的临床诊断并采取不必要的治疗,增加患者的痛苦。持续真正低水平hCG病例表现为持续长时间存在低水平hCG,但无可确定的滋养细胞和肿瘤的存在,对化疗无反应和轻微反应。可能可分为3种情况:一是葡萄胎妊娠后静息hCG,命名为静息妊娠滋养细胞肿瘤( quiescent gestational trophoblastic neoplasia);二是无妊娠滋养细胞疾病史,如在流产、异位妊娠或不规则阴道出血后真正低水平hCG,命名为不明原因hCG升高(unexplained elevated hCG);最后是罕见的可为雌激素抑制的hCG,称为垂体性hCG或类固醇激素反应性hCG(pituitary hCG or steroid hormone responsive hCG)。由于真正低水平hCG是一新认识的GTT综合症,包含了不同的疾病,对其了解甚少。在这组综合症中,部分病例hCG突然快速升高,此时经CT或MRI可发现肿瘤病灶。真正低水平hCG的GTT综合症与hCG检测中的假阳性鉴别在实践中尚存在一定的困难,一方面低水平hCG可在部分病例持续相当长的时间而无临床表现;另一方面排除假阳性的方法与手段并不是各个实验室都具备也不一定有效,探索中检测hCG相关分子有助于鉴别真正低水平hCG。

  用hCG的检测做妊娠试验已有近80年的历史,最初使用生物活性试验。上个世纪70年代以后,免疫学检测方法替代了生物活性试验。由竞争性放射免疫测定法发展为目前广泛使用的以双抗体夹心免疫反应为基础的标记免疫测定法。有关免疫测定中的假阴性和假阳性问题在1970s已有报道,主要是LH交叉和蛋白溶解酶导致的hCG假阳性。1998年美国0turk对517例正常非孕血清作hCG测定,结果:196例女性血清有30例呈现阳性结果(15%),所有阳性者均为45岁以上年龄妇女, 绝经前后妇女30%者可呈hCG阳性,66%的年龄45岁的女性可测到游离α-亚基;321例男性血清中6例阳性(1.85%),4%的男性可测到游离α-亚基;β-亚基的检出率0.6%(3/520);这是由于LH、FSH 的增高出现hCG假阳性。然而随着标记免疫技术的提高测定hCG时与LH、FSH的交叉免疫反应几乎已经克服。

  1980s中期,Hussa和Cloe提出GTT中hCG试验的“地平线概念”即认为定量hCG试验是监测GTT治疗反应的最重要指标,理想的hCG试验能识别真正低水平的hCG和阴性hCG,可减少不必要的治疗,但又不延误必要的治疗。临床实践中,存在hCG测定结果与临床不一致,即检测到低水平的hCG,但临床无妊娠和肿瘤证据的现象。Tyver等1995年注意到现代hCG检测的高敏感性,已可测定在正常人和不可解释原因存在的低水平hCG。1998年Cole首先正式报道3例由于假阳性hCG试验结果,导致错误诊断和不必要治疗。他使用幻影hCG(phantom hCG)和幻影绒癌 (phantom choriocarcinoma)的概念,提出在低水平升高hCG,无临床疾病证据时首先需确定的是真正的hCG抑或是检测导致的假阳性结果。2000年在著名Lancet杂志上他们发表扩大样本至18例的报道。在美国的另一研究组Olsen等报道了2例假阳性hCG诊断为GTT,并就一些观点在Cole 和Olsen 之间展开了讨论。目前用标记免疫技术检测hCG至少使用两种动物抗体,包被于试管等固相载体上的为第一抗体,与hCG分子的一部位结合捕获hCG,第二种抗体为携带标记物的液相鼠、羊、兔或山羊多克隆抗体,与已捕获的hCG上的另一部位结合,当血清中存在hCG,即可以hCG分子为桥梁形成三明治样结构。导致hCG假阳性的可能原因是人接触鼠、兔、山羊和绵羊血清能导致相应的人的异源性抗体产生。这些抗体与现代夹心免疫测定中使用的鼠、兔、山羊和绵羊抗hCG球蛋白结合和交叉连接导致假阳性结果,这是所有用标记免疫检测技术检测人血清物质都会存在的问题。异源性抗体是大分子,不能经尿排出。目前文献报道判断假阳性hCG方法包括(1)尿液hCG试验:若血清hCG50mIU/ml,而尿液阴性,则判断为假阳性;(2)血清稀释试验:若血清稀释试验无线性关系,则为异源性抗体干扰;(3)异源性抗体阻止剂的使用:在hCG试验进行前,使用阻止剂预处理待测定的血清,若结果为阴性,判断为异源性抗体导致假阳性结果。(4)不同实验室,不同实验方法重复测定。2002年11月美国妇产科学院(ACOG)妇科实践委员会以题为“避免假阳性hCG试验导致的不必要治疗”,发表278号委员会意见,指出虽然现代实验测定方法几乎可排除实验错误,但假阳性和假阴性结果可能存在于任何标本中,因此在临床发现和实验结果不一致时,可能存在实验结果假阳性导致的不必要治疗,临床医生必须判断是等待肯定结果抑或是立即开始治疗的危险性大小。对存在hCG测定结果可能受干扰的病人,应告知有可能重复出现,并在病例上记录。

  最近浙江大学妇产科医院吕时铭、石一复等对妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血肿瘤细胞检测方法进行研究,由于妊娠滋养细胞肿瘤起源于妊娠时胚外层的滋养细胞,具有增生活跃和易侵入母体血循环导致早期血行转移的特点。该肿瘤特征性分泌的hCG是理想的肿瘤标志物,一直用于该肿瘤诊断、治疗监测与随访。近年来随着分子生物学技术的发展,在外周血中检出肿瘤细胞的技术得以迅速发展,但用于检测妊娠滋养细胞肿瘤尚未见报道。是否可以利用妊娠滋养细胞肿瘤细胞在分泌hCG时伴随着细胞内hCG-mRNA的表达的特点,以hCG-mRNA作为滋养细胞标志,检测进入外周血中的滋养细胞肿瘤细胞,是一个值得研究的问题,这可能有益于肿瘤转移的早期诊断。

  1、循环血中β-hCG-mRNA检出方法的建立 荧光定量PCR融汇了PCR和DNA探针杂交技术的优点,采用荧光定量PCR技术原理为Taman技术,根据PCR反应动力学特点,能获得DNA模板的准确定量结果。实验所用引物及荧光探针均采用美国PE公司DNA荧光定量分析专用软件设计,β-hCG基因组序列参考有关文献,对JAR细胞的β-hCG-mRNA先行逆转录,而后行荧光定量PCR分析,结果表明,使用本研究所设计的β-hCG-mRNA引物与荧光探针可以检测到相当于1个JAR细胞表达的β-hCG-mRNA量,且荧光增强随着模板浓度增加而增加,从1个细胞的模板浓度到105细胞的模板浓度呈良好的线性关系,提示本研究所设计的β-hCG-mRNA引物与荧光探针以及所用的反应程式可有效地用于β-hCG-mRNA的检测,是检测β-hCG-mRNA进而推算hCG分泌细胞数量的有用方法,为研究妊娠期滋养细胞进入母体外周血的意义以及妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血中的肿瘤细胞提供了方法学基础。

  2、妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血中检测肿瘤细胞的意义 妊娠滋养细胞疾病(肿瘤)是与妊娠相关的一组疾病,包括:葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌和胎盘部位滋养细胞肿瘤。完全性葡萄胎和部分性葡萄胎的恶变率分别为20%和5%-8%,而几乎所用的侵蚀性葡萄胎和约占50%绒毛膜癌来自于葡萄胎。因此,葡萄胎患者被要求随访。恶变者具有血行转移之特点,循环血液中存在肿瘤细胞是血行转移的基本条件之一,然而要检出循环血液中存在肿瘤细胞较难。

  吕时铭等将已知数量的JAR细胞掺入正常外周血中,然后测定其β-hCG-mRNA的量,推算混入血液中的细胞量,并以此作为外标准,通过测定妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血中β-hCG-mRNA的量,推算患者外周血中相应肿瘤细胞的量。结果显示,尽管FQ-PCR法可以检测到相当于1个JAR细胞表达的mRNA量,但是当JAR细胞掺入外周血后再分离,只有在每10ml中超过102时方能检测到,此后随掺入JAR细胞数量的增加,FQ-PCR所需的循环数减少,呈现较好的量效线性关系,与所测得的对等数量的未掺入外周血中的JAR细胞所表达的β-hCG-mRNA的量相近,提示本研究中采用的FQ-RT-PCR能很好地定量检测hCG-mRNA,进而推算hCG分泌细胞的数量,但从母血中富集细胞的方法尚需优化。当然,作为一种实验方法尚需经特异性、灵敏度、抗干扰等多项评价,而本研究结果则为在外周血中利用细胞特异表达的hCG-mRNA检出滋养细胞进行了实验探索。另一方面也为在其他肿瘤患者外周血中检测肿瘤细胞提供了方法学的启示。

  本研究结果虽然只在9例中4例妊娠滋养细胞肿瘤患者额外周血中检测到β-hCG-mRNA,推测这些病例外周血中存在有妊娠滋养细胞肿瘤细胞,虽然病例数所限无法从临床分期等方面分析,但已能说明用本研究方法可能是检测和证明妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血中存在肿瘤细胞的有用手段。当然其临床应用价值则需要病例的积累与动态观察。以往对滋养细胞的诊治研究的一个重要方面是有关肿瘤标记物hCG的研究,hCG是其特异与敏感的肿瘤标志物,这对于妊娠滋养细胞肿瘤的诊断与治疗观察与随访均有重要意义,但是外周血中测到hCG只能说明基因产物已分泌进入血循环,只能反映体内是否存在滋养细胞,以及滋养细胞量的多少,并不直接反映hCG分泌细胞(滋养细胞)是否已进入血液循环,而外周血中β-hCG-mRNA的检测有助于判断是否有滋养细胞存在于外周血循环中,这对更加准确的诊断和治疗妊娠滋养细胞肿瘤是一有价值的贡献。在妊娠滋养细胞肿瘤患者外周血中测到β-hCG-mRNA只提示有较多的肿瘤细胞进入血循环,而这是否与患者的临床分期和WHO预后评分有关,是否与肿瘤的转移、预后有关,以及能否作为改变治疗方案或进一步治疗的指示性标志之一则需要多病例与长时间的病例跟踪与预后调查,方可得出结论。鉴于妊娠滋养细胞肿瘤的转移主要为血行转移,因此对于外周血中β-hCG-mRNA阳性者可能应较单纯hCG阳性者给予更多的关注。秒速时时彩计划

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